Métodos de Histologia

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  • Microscopia

Na aula prática , foi constado que o microscópio possui vários componentes e que cada um possui uma determinada função. Entre os componentes podemos citar: lente ocular (10x), tubo binocular, revólver, objetiva (4x,10x,40x,100x), prendedor de lâmina, diafragma do condensador, diafragma do campo, base, regulador da intensidade luminosa, macrométrico e micrométrico. Todos esses componentes funcionam em conjunto com o objetivo de aumentar a imagem a ser visualizada.

Durante a prática foi aprendido a manusear o microscópio, entre os conceitos básicos estão, verificar se a voltagem do aparelho condiz com a da tomada, antes de ligar ajustar a intensidade da luz e deixar o aparelho na objetiva de 4x.

Para o ajuste do foco é necessário o manuseio do macro e micrométrico sendo que o macro serve apenas para a primeira aproximação e micro para o ajuste final, pois seu movimento é mais sensível.

  • Histologia

Na primeira aula em laboratório de histologia foi posto em prática conceitos visto em sala de aula, onde revisamos passo a passo o preparo de lâminas através do método com parafina.

O primeiro passo é a colheita que pode ser realizada através de necropsia.

O segundo passo é a fixação, que pode ser usado formaldeído,  álcool, acido acético ou acido pícrico, que tem como objetivo interromper a morte programada da célula e manter como proporção de 30/1 em pelo menos 24 horas.

O terceiro passo é a desidratação, que tem como objetivo eliminar toda água existente na célula. Para isso se usa o etanol 70% até chegar ao 100%.

O quarto passo é a diafanização que tem como objetivo garantir que não existe mais água na célula. Nesse processo é usado o xileno, que torna miscível o tecido com a parafina.

O quinto passo é a inclusão, em que se utiliza a parafina quente no seu ponto de fusão (mais ou menos 45ºC).

O sexto passo é o corte, realizado pelo micrômetro, esse corte deve ser extremamente fino com aproximadamente 5µm.

O sétimo passo é o banho-maria em que a parafina derrete e cola na lâmina de vidro, que seria a montagem.

O oitavo passo é a coloração. Nesse processo é removido a parafina e hidratado o tecido que seria corado e desidratado rapidamente em álcool 70% a 100%.

Para finalizar o processo é realizada a montagem da lâmina, e deixando a mesma em bálsamo do Canadá para conservação do tecido.

Métodos de estudos Histológicos

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Vários são os métodos de estudos dos tecidos, variando do estudo dos tecidos in vivo até aqueles que utilizam os tecidos mortos. O método mais utilizado em Histologia é o preparado histológico permanente (lâmina histológica) estudado em microscópio óptico. A seguir descrevemos as etapas de produção de uma lâmina histológica:

1ª Etapa: Coleta da Amostra

A primeira etapa de todo o processo de preparação de uma lâmina histológica consiste em coletar a amostra, ou seja, obtê-la e isto pode ser feito, por exemplo, por necropsia.

As peças cirúrgicas grandes ou de autópsia devem ser clivadas previamente para reduzir sua espessura permitindo a penetração fácil do fixador. O princípio fundamental de clivagem é que o fragmento possua em torno de 4 mm de espessura.

 

2ª Etapa: Fixação

A base de uma boa preparação histológica é a fixação que deve ser completa e adequada. Para tanto é preciso tomar algumas precauções que são obrigatórias:

a) O material coletado deve ser imerso rapidamente no fixador;

b) O volume de fixador deve ser em torno de 30 vezes maior que o volume da peça coletada.

 

Os principais objetivos da fixação são:

a) Inibir ou parar a autólise tecidual;

b) Coagular ou endurecer o tecido e tornar difusíveis as substâncias insolúveis;

c) Proteger, através do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e procedimentos técnicos posteriores;

d) Preservar os vários componentes celulares e tissulares;

e) Melhorar a diferenciação óptica dos tecidos;

f) Facilitar a subseqüente coloração.

 

3ª Etapa: Desidratação

Antes que um material de inclusão, tal como a parafina, possa penetrar no tecido seu conteúdo em água deve ser removido. A desidratação é levada a efeito imergindo o bloco de tecido em concentrações crescentes de álcool etílico. O álcool é o agente mais comumente utilizado neste processo, sendo empregado numa série crescente (70% – 80% – 90% – 100%) para se evitar a retração pronunciada do tecido ocasionando lesões estruturais da célula de caráter irreversível. O álcool tem a vantagem de endurecer mais o tecido. O volume de álcool deverá ser 10 a 20 vezes maior que o volume da peça.

Várias são as substâncias utilizadas como agentes de desidratação: álcoois etílico, butílico, metílico e isopropílico, a acetona, o éter, o clorofórmio e o óxido propileno. O álcool etílico é o mais utilizado em técnica de rotina.

4ª Etapa: Diafanização (Clarificação)

A impregnação do tecido com meio de inclusão é impossível nesse estágio porque as substâncias semelhantes à parafina usadas para a inclusão não se misturam com o álcool. O tecido deve, portanto, ser imerso em um produto químico e que o álcool e a parafina sejam solúveis. Assim a diafanização consiste na infiltração do tecido por um solvente da parafina que seja ao mesmo tempo desalcolizante. A parafina não se mistura com água e nem com álcool. Ambos devem ser completamente removidos para que a parafina possa penetrar eficientemente no tecido. O xilol é comumente utilizado. Tal produto químico é muitas vezes chamado de agente clarificador porque torna o tecido semi-translúcido, quase transparente. Entre os reagentes mais utilizados na fase de diafanização podemos citar ainda: toluol, clorofórmio, óleo de cedro, benzol e salicilato de metila.

A quantidade de xilol (substância mais empregada) utilizada deve ser 10 a 20 vezes o volume da peça. A duração da clarificação varia com as dimensões, a constituição do material e a temperatura.

5ª etapa: Inclusão (Impregnação)

A finalidade da impregnação é eliminar completamente o xilol contido no material e a total penetração da parafina nos vazios deixados pela água e gordura, antes existentes no tecido. Este processo serve também para preparar o material para os cortes, removendo o clarificante e endurecendo-o suficientemente e dando-lhe a consistência adequada para que possa ser cortado.

O tecido é passado em duas trocas de parafina para assegurar a substituição de todo o agente clarificador pela parafina. Emprega-se a parafina a uma temperatura em torno de  45 C (parafina fundida). O bloco de tecido permanecerá imerso na parafina fundida (em estufa) durante o tempo necessário para a completa impregnação. Posteriormente serão retirados da estufa e deixados à temperatura ambiente até que a parafina endureça, após isto o bloco de parafina com o tecido será retirado da fôrma e conduzido ao corte. Pode-se citar ainda como agentes de impregnação: celoidina, goma arábica, parafina plástica, polietileno glicol e parafina esterificada.

6ª etapa: Microtomia (corte)

Para se obter cortes de material incluído em parafina ou por congelação é necessário um instrumento especial: o micrótomo. Os micrótomos variam de acordo com os fabricantes e tem como fundamento duas peças principais: o suporte ou mandril (onde é fixada a peça a cortar) e a navalha. O suporte é sempre encaixado a um parafuso micrométrico ou a uma espiral metálica que o faz adiantar segundo seu eixo, em medida conhecida e que pode ser regulada à vontade. Esta medida tem como unidade o micrômetro que corresponde à milésima parte do milímetro. Normalmente um micrótomo faz cortes cuja espessura varia de 1 a 50 micrômetros, mas a espessura mais utilizada em microscopia óptica é de 4 a 6 micrômetros. Há vários tipos de micrótomos: rotativo, tipo Minot, de congelação e o destinado a trabalhos de microscopia eletrônica.

7ª etapa: Colagem do Corte à Lâmina

As fitas de cortes de parafina são estiradas cuidadosamente e os cortes individuais são separados por um bisturi. Na superfície de uma lâmina de vidro é feito um ponto de aderência (normalmente com albumina de ovo) e o corte de parafina é colocado em banho-maria (água morna) de forma que as dobras provocadas pelo corte no tecido desapareçam. Após o que o corte é “pescado” com a lâmina, preparada com albumina, na qual se adere.

8ª etapa: Coloração

É a técnica tintorial empregada para facilitar o estudo dos tecidos sob microscopia. A coloração é de importância fundamental em histologia, pois os tecidos não tratados têm pouca diferenciação óptica. As colorações de um modo geral se efetuam por processos físico-químicos ou puramente físicos e podem ser consideradas, segundo a modalidade, a ação, o caráter, o grau de ação, o tempo, o número de corantes e a cromatização.

Quanto à cromatização, ou seja, de acordo com o número de cores conferidas às estruturas pelas colorações simples ou combinadas, estas tomam a denominação de colorações monocrômicas (uma cor), bicrômicas (duas cores), tricrômicas (três cores) e policrômicas (mais de três cores).

Para se corar convenientemente a célula, deve-se recorrer a um método de coloração sucessiva do núcleo e do citoplasma.

A combinação mais comum de corantes usada em Histologia e Histopatologia é a Hematoxilina e Eosina (HE). A hematoxilina é um corante natural obtido da casca de pau campeche. Ela não é realmente um corante e deve ser oxidada em hemateína a fim de tornar-se um corante. Ademais, o corante que resulta (hematoxilina-hemateína) não tem afinidade para os tecidos. Deve ser usado um mordente, como o alumínio ou o ferro, juntamente com a mistura de hematoxilina antes que ela possa corar os tecidos. A mistura cora em azul-púrpura. A eosina é um corante sintético e produz uma coloração vermelha.

Nas células coradas com HE os ácidos nucléicos presentes no núcleo são corados pela hematoxilina, dando ao núcleo um tom azul-púrpura. A eosina é atraída pelos elementos básicos da proteína do citoplasma da célula, corando-o de róseo a vermelho. Os componentes dos tecidos que se coram prontamente com os corantes básicos são chamados basófilos; os que têm afinidade pelos corantes ácidos são chamados acidófilos. A hematoxilina comporta-se como um corante básico e, portanto, cora o núcleo de modo basófilo. A eosina é um corante ácido e cora os elementos básicos da proteína do citoplasma de maneira acidófila.

Antes que o corte seja corado, a parafina em que ele foi incluído deve ser removida. O corte, que já foi aderido à lâmina de vidro (pescagem em banho-maria), é banhado no xilol para dissolver a parafina. Devido ao fato de muitos corantes serem solúveis em água, torna-se necessário remover o xilol do tecido e substituí-lo por água (hidratação). O corte é imerso em uma série de concentrações decrescentes de álcool etílico até que esteja hidratado. Depois que o corte estiver hidratado procede-se à coloração propriamente dita. No caso da HE, o tecido é imerso primeiramente em hematoxilina, lavado com água para retirada de excedente, depois imerso em eosina e, após isto também se faz lavagem do tecido.

9ª etapa: Montagem

Depois que o corte tiver sido corado com a solução apropriada, ele é passado através de concentrações crescentes de álcool para remover, de novo, a água (desidratação). Objetiva-se com esta desidratação aumentar a sobrevida do preparado histológico.

Finalmente, o corte é banhado em xilol antes de ser montado em um meio solúvel em xilol, que é o meio de montagem (para os cortes de parafina é usado o Bálsamo de Canadá). Uma gota do meio de montagem é colocada sobre o corte e a lamínula é posicionada sobre o corte de forma

delicada, de uma forma tal que o meio de montagem cubra completamente o corte. Depois a lamínula é comprimida com firmeza sobre o corte e o meio de montagem se espalha formando uma delgada película entre a lâmina e a lamínula que posteriormente vão estar firmemente aderidas uma à outra pela estabilização do meio de montagem.

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